小鼠局部淋巴結(jié)試驗（LLNA）檢測

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小鼠局部淋巴結(jié)試驗（LLNA）檢測概述

小鼠局部淋巴結(jié)試驗（Local Lymph Node Assay, LLNA）是一種用于評估化學(xué)物質(zhì)皮膚致敏性的標(biāo)準(zhǔn)化毒理學(xué)檢測方法。與傳統(tǒng)豚鼠試驗相比，LLNA具有動物使用數(shù)量少、實驗周期短、結(jié)果客觀性高等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于化妝品、藥品、農(nóng)藥及工業(yè)化學(xué)品的致敏性評價。該試驗通過檢測小鼠耳部接觸受試物后局部引流淋巴結(jié)中淋巴細胞的增殖反應(yīng)，定量評估物質(zhì)的致敏潛力。自1992年被OECD（經(jīng)濟合作與發(fā)展組織）采納為標(biāo)準(zhǔn)方法（OECD TG 429）以來，LLNA已成為皮膚致敏性檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一。

檢測項目

LLNA的核心檢測項目包括：
1. **皮膚致敏性評估**：判定受試物是否具有引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的能力。
2. **致敏強度分級**：通過刺激指數(shù)（SI）量化物質(zhì)的致敏強度。
3. **劑量-反應(yīng)關(guān)系分析**：確定致敏效應(yīng)的濃度閾值。
4. **免疫反應(yīng)特異性檢測**：評估T淋巴細胞激活標(biāo)志物（如CD69、CD25）的表達水平。

檢測儀器

LLNA試驗中需使用以下關(guān)鍵儀器設(shè)備：
1. **流式細胞儀**：用于分析淋巴細胞表面標(biāo)記物及增殖狀態(tài)。
2. **酶標(biāo)儀**（ELISA檢測系統(tǒng)）：定量檢測細胞因子（如IL-2、IFN-γ）釋放水平。
3. **液體閃爍計數(shù)器**：測量³H-胸苷摻入量以評估DNA合成速率。
4. **顯微操作設(shè)備**：分離耳部引流淋巴結(jié)。
5. **實時熒光定量PCR儀**：分析免疫相關(guān)基因表達變化。

檢測方法

LLNA標(biāo)準(zhǔn)操作流程分為四個階段：
1. **動物分組與給藥**：將BALB/c或CBA/J小鼠隨機分組，連續(xù)3天于耳背涂抹受試物。
2. **淋巴結(jié)細胞分離**：第5天處死動物，無菌取出耳部引流淋巴結(jié)制備單細胞懸液。
3. **細胞增殖檢測**：通過³H-胸苷摻入法或BrdU ELISA法測定淋巴細胞增殖率。
4. **數(shù)據(jù)分析**：計算刺激指數(shù)（SI=實驗組CPM/溶劑對照組CPM），SI≥3判定為陽性反應(yīng)。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

LLNA實施需嚴格遵循認可的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范：
1. **OECD TG 442B**：新修訂版（2021年）規(guī)定了實驗設(shè)計、動物福利及數(shù)據(jù)解釋標(biāo)準(zhǔn)。
2. **ISO 10993-10**：醫(yī)療器械生物學(xué)評價中的致敏試驗要求。
3. **EPA 712-C-03**：美國環(huán)保署化學(xué)品測試指南。
4. **GLP規(guī)范**：實驗全過程需符合良好實驗室規(guī)范要求，確保數(shù)據(jù)可追溯性和重現(xiàn)性。

技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用前景

隨著3R原則（替代、減少、優(yōu)化）的推進，LLNA正向體外化、高通量方向發(fā)展?；贏TP生物發(fā)光法的LLNA:DA（直接肽反應(yīng)試驗）等改良方法已逐步應(yīng)用，進一步提高了檢測效率和預(yù)測準(zhǔn)確性。未來結(jié)合組學(xué)技術(shù)（如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)），有望實現(xiàn)更的致敏機制解析與風(fēng)險分級。